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共聚焦使用常见问题
发布者: 生命科学学院实验服务中心 发布日期:2016-12-12
1.染料的激发波长和发射波长?
        共聚焦显微镜采用激光作为光源、光电倍增管(PMT)作为信号采集器,所以在拍摄共聚焦图像前,需要查询荧光蛋白的资料或荧光染料的说明书,记下具体的激发光波长范围和发射光波长范围,便于共聚焦软件的参数设置。
 
2.物镜和ZOOM值的选用?
        共聚焦显微镜一般配置了10X、20X、40X物镜和63X、100X油镜,通过使用更大倍数的物镜,我们可以观察到样品上更精细的结构;同时,共聚焦显微镜也配置ZOOM值(即电子变倍)调整功能,通过调整ZOOM值大小,也可以实现对样品图像的放大与缩小。但是,由于ZOOM值的增大属于电子放大,放大倍数越高,清晰度越差,ZOOM的增大是有限定的,一般来说,ZOOM 值调整范围控制在0-2倍之间,超过2就没有太大意义了。
 
3.串色?
        在使用多种荧光染料标记样品时或者样品本身(组织样品)有很强的自发荧光时,容易发生串色现象。串色一般分为两种情况:(1)两种荧光染料的激发光谱没有重叠,但是发射光谱有重叠。这类串色可以通过顺序扫描(序列扫描)来完成:依次拍摄不同通道的荧光染料或者荧光蛋白。(2)两种荧光染料的激发光谱和发射光谱都有重叠,这种情况在实验前应尽量避免出现这样的情况,如果无法避免(组织样品),可以通过光谱扫描来弥补。
 
4.扫描背景太强?
        首先,制备高质量的荧光样品;
        其次,根据样品的制备质量,依次调整针孔大小(Pinhole)、光电倍增管电压(Gain Master)、焦平面、激光强度(Laser)、信噪比(Offset)等参数;
        再次,扫描时使用Average(数学平均方法)进行图像平滑降噪;
        最后,图像扫描完成后可以通过共聚焦软件中的图像处理功能或者第三方图像处理软件(Photoshop)来调节亮度、对比度等去除背景,使图像质量最佳化。
 
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